荧光定量PCR介绍

实时定量PCR技术于1996年由美国ABI公司推出，由于该技术不仅实现了从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、更能有效的解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，以成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。目前最常用的实时定量方法是染料（SYBR Green I）法和TaqMan探针法两种。该技术已经广泛应用于分子生物研究的各个方面，如：DNA定量、RNA定量、SNP分析、基因型分析、RNA变异分析等。

1.染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。

图 1. SYBR GREEN I 工作原理

图2：实时荧光定量PCR(SYBR Green I法)熔解曲线

由熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到的定量结果。

2.TaqMan 探针法：

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。

图 3. Taqman 探针工作原理

实时荧光定量PCR服务操作流程：

客户提供目的基因名称、序列或GeneBank Id号

我公司设计并合成PCR引物及Taqman探针(探针法）

Real-time PCR实验

提供实验报告(实验过程、实验条件、使用的仪器及试剂、标准品扩增曲线、标准曲线、样品扩增曲线、熔解曲线、Ct值及拷贝数)